脓毒症基础研究的新进展及面临的挑战
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脓毒症基础研究的新进展及面临的挑战
脓毒症是宿主对感染反应失调引起的危及生命的器官功能障碍。因其高发病率和高病死率，给社会带来了巨大的疾病负担，被视为全球健康领域的重大挑战之一 [ 1 ]。尽管人们对脓毒症的认知水平从"脓毒症1.0"提高到了"脓毒症3.0"，对脓毒症的临床诊治共识——"拯救脓毒症运动"也在不断更新和修订，但脓毒症患者的预后仍不理想。脓毒症的复杂性不仅源于其病理生理机制尚不明确，还源于患者个体的异质性 [ 2 ]。因此，需要充分利用新技术、新方法加强脓毒症基础研究以进一步探明其发病机制和影响因素，为改进脓毒症的临床管理提供新思路或新策略，最终改善脓毒症患者的预后。本文将对脓毒症基础研究的新进展及面临的挑战进行概述，期望能为脓毒症的研究提供参考。
1 脓毒症与基因多态性
随着对脓毒症研究的不断深入，人们对脓毒症的认知已经扩展至基因层面。脓毒症的基因多态性是指在影响脓毒症发展和严重程度的基因中存在的遗传变异，这些变异可以影响个体对感染的反应、炎症反应的强度和持续时间，以及免疫系统的整体功能 [ 3 ]。对脓毒症基因多态性的研究有助于揭示脓毒症的复杂遗传机制，能个体化评估患者脓毒症风险，并可能促进开发更有效的预防和治疗策略，例如基于患者特定基因型的个体化治疗。
有学者开展了对成人脓毒症患者28 d生存率的全基因组关联研究，确定了3个与脓毒症28 d生存率降低相关的独立低频变异，分别位于SAMD9（rs34896991）、SLC5A12/FIBIN（rs146257041）和LINC00378/MIR3169（rs138347802）基因位点 [ 4 ]。SAMD9基因的上调与巨噬细胞聚集、T细胞活化及抗炎作用有关，因此SAMD9的错义突变可能会抑制脓毒症时的免疫调节作用。SLC5A12/FIBIN和LINC00378/MIR3169两个基因研究较少，但主要与DNA损伤相关。还有研究确定了脓毒症脑病中的7个枢纽基因，分别为GPR4、SOCS3、BAG3、ZFP36、CDKN1A、ADAMTS9和GADD45B，其主要在缺氧和炎症反应中起作用，与先天性和适应性免疫细胞密切相关，这些基因在肝硬化脓毒症患者中具有良好的诊断价值，也可能成为新的治疗靶点 [ 5 ]。Neyton等 [ 6 ]研究发现，脓毒症的高炎症表型与低炎症表型存在31%的基因表达差异。高炎症表型与先天性免疫应答基因的表达升高有关，而低炎症表型与适应性免疫应答基因的表达升高有关，尤其是T细胞应答基因。高炎症表型的肠杆菌科脓毒症发病率和细菌DNA丰度较高，而低炎症表型使用皮质类固醇可能产生不良后果，这些研究结果为脓毒症患者的个体化治疗提供了参考。与革兰阴性菌脓毒症相关的Toll样受体4（Toll-like receptor 4，TLR4）多态性（如Asp299Gly和Thr399Ile）可导致对脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）的反应显著减弱。有研究显示，Lys694Arg（K694R）多态性通过降低核转录因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）的激活，影响了下游炎症因子白细胞介素（interleukins，IL-1、IL-6）和肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的生成，导致对LPS的反应性减弱。K694R多态性对TLR4表达没有影响，但是K694R可以减少TLR4信号转导中髓样分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）的募集 [ 7 ]。
基因多态性研究在揭示脓毒症发病机制和个体易感性方面具有重要意义，但也面临着一些挑战：①基因多态性研究往往需要考虑多个基因的协同作用、基因之间的相互作用以及基因与环境之间的相互作用，增加了研究的复杂性。②基因多态性研究需要大量样本和临床数据的严格整合，以覆盖脓毒症的临床异质性。③基因多态性研究的复现性和验证是一个重要挑战。由于研究中可能存在样本选择偏倚、分析方法差异等影响因素，不同研究结果之间可能存在较大差异。因此，需要进行大样本的复现研究和功能验证实验，以验证基因多态性与脓毒症之间的关联。④基因多态性研究需要运用生物信息学和统计学方法对大量基因数据进行分析和解读，涉及数据清洗、统计分析、生物信息学工具的选择和使用等方面的挑战。
2 脓毒症与微生物
导致脓毒症的病原菌种类繁多，包括大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、链球菌和念珠菌等 [ 8 ]。有关全球脓毒症相关病原菌流行病学研究指出，各地区主导的病原菌类型及其致病性可能存在差异。在美国，化脓性链球菌相关性中毒性休克综合征的分布并不均匀，其中成人为22.5%，儿童为7.1%；在刚果民主共和国，中毒性休克综合征毒素-1（toxic shock syndrome toxin-1，TSST-1）在金黄色葡萄球菌血液感染中检出的比例较高，其中耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）为67%，甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌（MSSA）为4%；在中国，TSST-1在MRSA血液感染中的比例为23.1%，在MSSA血液感染中的比例为6.7% [ 8 ]。欧洲抗菌药物耐药性（antimicrobial resistance，AMR）研究显示，MRSA的耐药性随患者年龄增加而升高，大肠杆菌对氨基青霉素的耐药性随患者年龄增加而下降，而铜绿假单胞菌的耐药性在患者30岁时达到峰值 [ 9 ]。对于大多数细菌，感染发病率随年龄增长呈"U"形模式，男性感染率更高；而大肠杆菌则在15～40岁女性中的发病率更高。这些差异提示针对不同的患病人群需要采取更加个体化的预防和诊治策略。
病原体导致的感染是脓毒症的主要病因，早期有效抑制或杀灭病原体对于脓毒症的预防和治疗至关重要 [ 10 ]。传统的抗菌药物存在效率低、缺乏靶向性和易产生耐药性等问题。针对以上问题，Zhang等 [ 11 ]构建了特异性靶向的抗菌肽，通过提高抗菌药物的靶向特异性，减少药物耐药性，为脓毒症的精准治疗提供了一种新的靶向致病菌杀菌策略。肠杆菌素是多种革兰阴性菌（包括所有大肠杆菌和沙门菌）产生和利用的儿茶酚类铁载体，其在清除细胞外环境中的Fe 3+后，可通过肠杆菌素摄取机制介导外膜的主动运输，是一种前景较好的递送载体，通过肠杆菌素药物偶联可增强抗菌效力和病原体靶向效果 [ 12 ]。还有研究报道，新型氨基功能化银纳米颗粒表现出对大肠杆菌耐药菌株的广谱杀菌活性，其作用机制可能是静电相互作用及诱导细菌细胞壁损伤 [ 13 ] 。
肠道菌群在维持宿主正常免疫功能中发挥着重要作用，可产生短链脂肪酸、多肽和苯丙酮酸等具有免疫调节及抗炎功能的分子 [ 14 ]。膳食纤维经益生菌发酵后产生的短链脂肪酸可以调节T细胞分化，减少炎症因子的产生。源自嗜黏蛋白-阿克曼菌的新型三肽RKH可与TLR4结合，阻断免疫细胞中的TLR4信号转导，显著减少脓毒症诱导的炎症细胞活化和促炎因子的过表达 [ 15 ]。真菌也参与了肠道免疫功能调节。肠道共生白色念珠菌产生的苯丙酮酸可以增强巨噬细胞的杀菌活性，减轻脓毒症小鼠的器官损伤 [ 16 ]。妊娠个体脓毒症易感性高，并具有更高的死亡风险，Chen等 [ 17 ]发现妊娠期会引起肠道微生物组变化，粪副拟杆菌及其衍生代谢物刺芒柄花素的含量降低，导致妊娠期宿主的巨噬细胞焦亡，机体免疫力降低，从而增加妊娠期宿主对脓毒症的易感性，了解这一机制有助于更好地评估妊娠期间脓毒症的发生风险。另有研究显示，在脓毒症或创伤后，甚至罹患脓毒症或创伤后长达2周内，患者肠道菌群中的真菌生态失调持续存在，真菌群落以念珠菌属为主，共生真菌物种耗竭。因此，评估此类患者的真菌感染风险对于临床治疗具有重要的意义 [ 18 ] 。
近年来，脓毒症相关微生物研究进展迅速，但仍面临着一系列挑战：①脓毒症可能由多种不同类型的细菌、真菌或病毒引起，且不同病原体的毒力和致病机制可能存在显著差异。②脓毒症微生物研究需要对样本中的微生物进行定量和定性分析，然而，样本来源多样、微生物数量少、培养条件复杂等因素可能导致定量和定性分析困难。③传统的微生物培养和鉴定技术存在一定的局限性，例如培养时间长、某些致病菌不易培养等。虽然现代分子生物学技术如聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）、测序等能够提供更快速、准确的微生物诊断，但这些技术仍然存在一定的技术限制和成本问题。④微生物耐药性是脓毒症治疗的重要挑战之一，寻找新的抗菌药物或开发新的治疗策略是当前脓毒症微生物研究的一个重要方向。⑤微生物与宿主的相互作用在脓毒症的发病机制中起着重要作用。然而，微生物与宿主相互作用的复杂性使得研究难度增加，需要综合考虑微生物特性、宿主生理状态及宿主免疫系统等多个方面的因素。
3 脓毒症与高迁移率族蛋白B1（high-mobility group box 1，HMGB1）
脓毒症能引发机体产生过度的炎症反应，而HMGB1在炎症反应和免疫反应中扮演着至关重要的角色。作为一种晚期促炎细胞因子，HMGB1可以与炎症相关因子（如NF-κB）相互作用，从而对炎症反应产生重要影响 [ 19 ]。此外，HMGB1表达升高与脓毒症引起的多器官功能障碍密切相关。HMGB1参与了多个器官的炎症反应，突显了其在脓毒症病理过程中的全局性影响，为理解脓毒症导致的多器官功能障碍提供了重要线索。HMGB1还在程序性细胞死亡中发挥关键作用，涉及细胞的凋亡、坏死及凋亡样坏死等多个方面。HMGB1对细胞生存状态的影响揭示了其在调控细胞命运方面的多功能性。鉴于HMGB1在脓毒症中的多方面作用，其可能是潜在的治疗靶点。对HMGB1作用机制的深入了解有望为脓毒症治疗的发展提供新的方向。
脓毒症中HMGB1相关的炎症调节途径揭示了HMGB1在免疫调控中的多层面作用 [ 20 ]。作为关键调节因子，HMGB1不仅能够促进中性粒细胞形成中性粒细胞胞外陷阱（neutrophil extracellular trap，NET）和内皮细胞凋亡，介导炎症过程，而且能直接参与巨噬细胞激活，促进炎症因子释放。值得注意的是，细胞外释放的HMGB1还能通过与相应的受体结合，诱导细胞焦亡。HMGB1通过与高糖基终产物受体（receptor for advanced glycation end product，RAGE）/TLR结合，进而激活NF-κB信号通路，从而调控细胞的生存和炎症反应。这一连锁反应揭示了HMGB1在炎症调控中的复杂性和多样性 [ 21 ]。深入探索HMGB1在脓毒症中的作用有助于揭示其在炎症调控中的关键角色，尤其是在涉及中性粒细胞、内皮细胞和巨噬细胞等多种免疫细胞的复杂相互作用方面。
脓毒症时HMGB1通过与TNF-α和IL-1β相互作用形成一个动态的调节网络。TNF-α和IL-1β为早期炎症因子，在感染的初始阶段迅速响应，数小时内快速升高。相比之下，HMGB1释放发生的时间相对较晚。在释放持续时间方面，TNF-α和IL-1β在早期迅速升高，但也较快降低 [ 22 ]。而HMGB1升高后却能持续较长时间，反映了晚期的炎症状态。TNF-α和IL-1β在感染早期扮演着关键角色，是某些抗炎药物和生物制剂的潜在靶标。而HMGB1可能是更适合在疾病晚期干预的潜在靶标。其长时间持续性释放的特征提示其可能是脓毒症潜在的更稳定的炎症标志物。因此，对于脓毒症的治疗策略，综合考虑这些炎性因子，特别是其释放时间的不同，有助于更精准地制定干预措施和药物治疗方案。此外，HMGB1与脓毒症患者预后之间存在相关性。血浆中的HMGB1被认为可能成为评估脓毒症严重程度以及预测患者生存状况的潜在生物标志物 [ 23 ]。
因此，对HMGB1的研究不仅有助于更全面地理解炎症反应和免疫反应的调控机制，还为未来脓毒症治疗的创新性策略提供了新思路。
4 脓毒症与内皮功能障碍
内皮功能障碍是脓毒症发生发展的核心环节之一，保护内皮功能是脓毒症管理的关键 [ 24 ]。目前有诸多研究报道了一系列的策略和治疗手段以维持内皮细胞的正常功能，包括清除或拮抗损伤因子（如抗原吸附剂、LPS拮抗剂、血液净化等）、激活内源性保护机制〔如一氧化氮（NO）疗法、核转录因子E2相关因子2/血红素加氧酶-1（nuclear factor-erythroid 2-related factor 2/heme oxygenase-1，Nrf2/HO-1）信号通路激活剂、沉默信息调节因子（silence information regulators，SIRT1、SIRT6）激活剂等〕、应用外源性细胞保护剂（如抗氧化剂、一些中药成分等）。这些内皮细胞保护策略共同构成了一个多层次、多角度的防御体系，以期能更好地保护和改善脓毒症患者的内皮功能，然而对脓毒症患者临床结局的影响尚需更进一步的研究。
中性粒细胞和NET与脓毒症内皮细胞功能障碍密切相关 [ 25 ]，可导致内皮细胞通透性增加及糖萼降解。此外，中性粒细胞和NET还可以通过调节抗凝血系统和上调组织因子的途径，导致内皮细胞呈现促凝血状态。因此，中性粒细胞和NET在脓毒症中不仅是炎症的执行者，也是内皮细胞功能障碍的诱导因素。深入了解NET的作用机制和内皮细胞的响应，有助于进一步明确脓毒症的发生发展机制。同时，我们还要重点关注器官特异性内皮功能障碍和血栓形成的潜在机制。这一现象可能与不同器官的凝血和纤维蛋白溶解系统的差异相关，对血栓的形成和溶解速度产生显著影响 [ 26 ]。探明这些机制将有助于确定治疗的靶点，为个体化治疗策略提供科学依据。
脓毒症引起内皮功能障碍的机制涉及多个层面，包括炎症反应、血管活性物质释放、凝血系统激活等。研究者需要综合考虑这些因素之间的相互作用及其对内皮功能的影响。虽然目前已发现多种与内皮功能障碍相关的分子机制，但仍然有许多未知因素待解析。
5 脓毒症免疫治疗
脓毒症炎症信号通路及补体系统的激活，可诱导免疫效应细胞耗竭、免疫调节细胞增殖、免疫检查点表达，最终引起免疫抑制 [ 27 ]。在免疫抑制状态下，机体对感染病灶的清除能力减弱，继发感染和潜伏感染激活，最终导致器官功能障碍。因此，脓毒症免疫治疗的研究正在积极推进，包括使用免疫刺激因子（如γ-干扰素、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子）、间充质干细胞、负性共刺激分子抗体和抑制剂。免疫细胞的表面有许多检查点，可以抑制先天性免疫细胞功能（吞噬作用、病原体清除和细胞因子释放）并导致T细胞耗竭，主要包括程序性细胞死亡受体-1（programmed cell death protein-1，PD-1）及其配体（programmed death-ligand 1，PD-L1）、细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4（cytotoxic T-lymphocyte-associated antigen-4，CTLA-4）和其他负性共刺激分子。
有研究表明，抗PD-1或PD-L1抗体治疗可恢复中性粒细胞、单核细胞、自然杀伤细胞（natural killer cell，NK细胞）和T细胞等多种免疫细胞的功能 [ 28 ]。PROVIDE试验首次证明了基于精准医学的免疫治疗在脓毒症中的有益作用。该研究通过铁蛋白和每个单核细胞上的人类白细胞DR抗原（human leukocyte antigen-DR，HLA-DR）将不同免疫状态的脓毒症患者分为巨噬细胞活化样综合征（铁蛋白>4 420 μg/L）、免疫麻痹（HLA-DR受体/CD14单核细胞<5 000）和中间状态，阿那白滞素（Anakinra）治疗可改善巨噬细胞活化样综合征患者的短期预后 [ 29 ]。然而，目前尚无批准用于临床治疗脓毒症的特异性药物，对脓毒症的免疫微环境也暂未完全了解。脓毒症的免疫治疗仍有许多问题待解决，如应用免疫疗法的最佳时机、结合不同的免疫调节剂是否更有效、如何起作用等。考虑到脓毒症个体的高度异质性，并不是所有患者都能从免疫治疗中获益。免疫疗法有望重塑脓毒症的治疗方式，实现个体化治疗。
6 脓毒症生物标志物
早期诊断和快速干预对于降低脓毒症病死率至关重要。许多特定的生物标志物，如C-反应蛋白（CRP）、降钙素原（PCT） [ 30 ]、血清淀粉样蛋白A（SAA） [ 31 ]、IL-6、IL-10、单核细胞趋化蛋白-1（monocyte chemotactic protein-1，MCP-1） [ 32 ]、肾素 [ 33 ]、血脂谱 [ 34 ]、外泌体 [ 35 ]等，已在临床研究中被证实可以辅助提高脓毒症诊断的准确性，用于器官功能障碍的早期识别，协助风险分层。有研究强调了脓毒症表型分析对优化患者特异性诊断和治疗策略的重要性，免疫细胞表型可以根据临床和免疫学特征对患者进行分类，并制定相应的治疗策略 [ 2 ]。然而，上述生物标志物仍有局限性，其变化多涉及转录、翻译和蛋白质合成过程，这些过程会导致指标的反应延迟。免疫细胞的形态学变化在炎症启动时迅速出现，可以及时反映患者的免疫状态，是脓毒症的一种潜在生物标志物。有研究利用3D成像技术动态实时监测CD8 + T细胞的形态学变化，可以区分脓毒症的不同状态，与健康对照组相比，脓毒性休克组CD8 + T细胞和细胞核较其他时间点显示出更大的体积及更高的折射率 [ 36 ]。
Ran等 [ 37 ]的研究确定了CFD、FYN、ITGAM和VSIG4 4个关键基因作为脓毒症患者生存的重要预测基因，其中，CFD、FYN、ITGAM在脓毒症患者中表达下调，VSIG4表达上调。此外，FYN可能通过调节ELF1、PTCRA和RASGRP2等因子影响血小板功能。FYN激动剂可有效改善脓毒症大鼠的凝血功能障碍和存活率。FYN基因在脓毒症相关的凝血障碍中可能发挥重要作用，并有希望成为新的治疗靶点。微凝块与多种疾病有关，被推测为淀粉样蛋白-纤维蛋白聚集体，有研究显示入住重症监护病房（ICU）时的微凝块与脓毒症的初步诊断相关，微凝块数量多或较大的患者发生弥散性血管内凝血（DIC）的可能性更高，患者28 d病死率显著增加 [ 38 ]。由淀粉样蛋白-纤维蛋白聚集体定义的微凝块可能有助于识别脓毒症、预测不良凝血疾病和临床结果 [ 38 ]。蔡耿鑫等 [ 39 ]通过单细胞测序技术及数字PCR技术筛选得到的BATF、JUNB、CEACAM4、GNA15、C3AR1、TGFB1、MTCH1单核细胞差异基因集，对脓毒症患者具有良好的早期诊断效能。此外，有研究者利用单细胞RNA测序方法发现，在脓毒症患者中存在一种未成熟的骨髓来源的CD14单核细胞表型，该表型具有免疫抑制特性，称为单核细胞状态1（monocyte state 1，MS1）。研究表明，根据MS1细胞水平（低、中和高）可将脓毒症患者分为3组，中度和高度MS1组的疾病严重程度更高，更常出现休克症状 [ 40 ]。较高的MS1细胞百分比与血液中淋巴细胞相关基因和干扰素反应基因的下调有关，并伴有炎症反应的上调。高MS1细胞丰度可能表明广泛的免疫失调，不仅会导致免疫抑制，还可反映过度的炎症反应。
尽管现有的和新兴的生物标志物在脓毒症早期诊断或预测临床结局中展现出了一定价值 [ 41 ]，但由于脓毒症的异质性，这些标志物对脓毒症的诊断准确性和预后评估效能表现出一定的不稳定性。与每一种临床工具一样，生物标志物在帮助预测临床结果中发挥辅助作用。将生物标志物与现有的预测指标〔如序贯器官衰竭评分（SOFA）〕结合起来，有望提高脓毒症的诊断和预测性能。
脓毒症基础研究的深入提高了对其病理生理机制的理解，有助于揭示脓毒症发生发展的关键节点，为新治疗策略提供了理论基础。随着基因组学、蛋白质组学等新技术、新方法的不断发展，精准医学在脓毒症研究中的应用日渐增多，有望为个体化的精准治疗提供更有效的方案。此外，考虑到脓毒症患者之间较大的个体差异性，基础研究的结果在临床实践转化时仍然面临巨大的挑战。未来需要继续加强基础研究，进一步明确脓毒症发病机制，并积极探索新治疗策略，以改善脓毒症的治疗效果和预后。
引用：吴淼,白镓玮,严颜,等. 脓毒症基础研究[J]. 中华危重病急救医学,2024,36:(06)：561-566.