慢加急性肝衰竭患者并发感染的特点及对诊断的影响
慢加急性肝衰竭患者并发感染的特点及对诊断的影响
慢加急性肝衰竭(Acute-on-chronic liver failure, ACLF)是以慢性肝病为基础，伴有多器官功能衰竭和较高病死率为特点的临床综合征。由于ACLF患者免疫功能紊乱，其具有较高的并发感染率。并发感染的早期诊断有助于启动早期抗感染治疗并改善患者预后，但ACLF并发感染易漏诊，寻找新的诊断方法和感染生物标志物，可帮助提高诊断的可靠性和准确性。本文从ACLF患者并发感染的流行病学和免疫方面特点，及这些特点对诊断的影响做一综述。
慢加急性肝衰竭(ACLF)是一种病死率较高的严重临床综合征，ACLF的定义强调患者在慢性肝病基础上出现肝功能的急剧失代偿。感染，尤其是细菌感染，作为一种主要的发病诱因或并发症在ACLF发生发展中起着重要作用[1,2]。由于ACLF患者易出现肠道菌群易位和免疫功能紊乱，细菌或真菌感染发生率较高。ACLF并发感染与不良临床结局和高病死率密切相关，常见感染类型为自发性细菌性腹膜炎(SBP)、尿路感染、肺部感染和菌血症[1,2]。ACLF并发感染的早期诊断有助于及时启动针对性抗感染治疗，可显著改善ACLF患者预后，但因其容易漏诊，生物标志物和一些新兴诊断方法在早期识别感染并评估抗感染疗效等方面具有较高的临床应用价值。随着对ACLF患者并发感染的流行病学和免疫方面深入研究，了解这些特点对诊断的影响，以便更好地研究并评估生物标志物和一些诊断方法的临床价值。
1 流行病学特点
1.1 危险因素
在我国，引起肝衰竭的主要病因是HBV感染。HBV相关慢加急性肝衰竭(HBV-ACLF)患者发生细菌和真菌感染的情况比较复杂，感染发病率与多种因素相关。如年龄≥45岁，处于疾病晚期阶段，天冬氨酸转氨酶(AST)<538.5 U/L，丙氨酸转氨酶(ALT)<493.5 U/L，总胆红素(TBil)≥348.35 μmol/L，中性粒细胞比例>70%，住院天数≥30 d，白蛋白≤33.1 g/L和凝血酶原时间(PT)≥27.55 s等[3]。郭小敏和蒋玉凤[4]研究表明，全身炎症反应综合征(SIRS)高评分和降钙素原(PCT)高水平是HBV-ACLF患者并发感染的危险因素，SIRS联合PCT具有较高的感染预测价值，临床上SIRS评分标准包括患者入院时是否低体温或发热、呼吸急促、心动过速、白细胞计数增加等。刘亚迪等[5]研究发现，腹水、PCT升高、合并并发症≥2个是HBV-ACLF患者住院期间发生感染的危险因素。ACLF患者继发真菌感染的危险因素主要包括糖尿病、侵袭性操作、血液透析和抗菌药物使用等[6]。当ACLF患者合并糖尿病或肺部疾病、不合理使用抗菌药物或有糖皮质激素用药史时，HBV-ACLF患者并发侵袭性肺曲霉病(Invasive pulmonary aspergillosis, IPA)风险增加[7,8]。HBV-ACLF患者并发侵袭性真菌感染(Invasive fungal infections, IFIs)的发生率较高，HBV DNA水平可能是这些患者并发IFIs的独立危险因素，当HBV DNA拷贝数>3.16×103拷贝/mL，IFIs发生率显著增加[9]。
1.2 感染率和常见类型
目前国内对ACLF并发细菌感染的研究较少。曹竹君和谢青[2]认为，ACLF患者发生细菌感染高达66.1%，其中医院感染发生率高达53%，多重耐药菌感染更易进展为严重脓毒症，甚至进展为脓毒性休克。刘亚迪等[5]研究发现，ACLF患者细菌总感染率为57%，其中诊断时感染率为24%，住院期间感染率为33%。随着疾病进展，ACLF晚期患者感染发生率高达81%，较早、中期感染发生率明显升高；并发真菌感染常由"双重感染"引起，患者状态常极度危险并有较高病死率，医院感染是最常见的感染类型。43%ACLF患者发生IFIs，病死率较无IFIS患者显著升高[10,11]。也有文献报道ACLF患者IFIs发生率为14.7%，HBV-ACLF患者住院期间IFIs发生率高达47.6%[6]。Zhang等[12]研究发现，自身免疫性肝脏疾病相关ACLF表现出更多并发症和更高病死率，其中细菌感染患者的病情更加严重。
ACLF患者常见的细菌感染类型包括SBP、继发性腹膜炎、尿路感染、肺炎、自发性菌血症、继发性菌血症、皮肤与软组织感染、肠道感染和艰难梭菌感染，其他感染包括胆道感染、阑尾炎和胸膜炎等[1,13]。国内学者邬喆斌等[14]研究发现，ACLF患者多部位可继发真菌感染，最常见的是肠道感染，其次是呼吸道感染。其中，ACLF合并侵袭性念珠菌感染常见于呼吸道(34%)，其次分别是肾脏、腹腔、血液和食道等[6]。呼吸道感染部位与进行侵袭性操作及ACLF危重患者使用多种仪器相关[6]，真菌感染诊断标准存在3个特点[15]：(1)未考虑宿主因素和临床表现；(2)病理确诊IFIs；(3)从感染或非感染区域分离出致病真菌。
1.3 病原体
ACLF患者最常见的感染病原体是细菌，其中以革兰阴性菌为主，例如大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌等；也可见革兰阳性菌感染，以金黄色葡萄球菌和肠球菌为主[1]。对于培养阳性样本，革兰阴性菌占所有可检测细菌的61%，大部分是肠杆菌，这与肠道细菌易位有关[16,17]。导致SBP最常见的病原体是大肠杆菌，肺炎克雷伯菌是引起肺炎的一个最常见因素[18]。由于临床侵袭性操作次数增加和抗菌药物的不合理使用，微生物学监测及流行病学调查结果亦随之变化；革兰阳性菌感染率(主要是葡萄球菌)增加，耐药菌检出率也随之上升，包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)和耐万古霉素肠球菌(VRE) [19]。
真菌感染包括侵袭性念珠菌、条件致病的念珠菌和侵袭性曲霉感染等。口腔护理咽拭子、痰、尿液和粪便的真菌常规筛选对ACLF患者非常重要[3]。研究表明，ACLF合并侵袭性念珠菌感染(64%)较侵袭性曲霉多见(36%)[6]。Wang等[3]发现，在20个真菌样本中，分离出最多的是念珠菌。Cai等[20]研究发现，除1例感染肺炎患者是由茁芽丝孢酵母引起，其他20例患者均由假丝酵母感染引起。总之，念珠菌和曲霉是最主要的病原体，常见感染部位包括呼吸道和尿道[9]。肺部细菌感染可并发IFIs感染，导致呼吸功能迅速衰竭，可能较顽固的感染性腹膜炎更难得到控制[21]。
2 免疫相关机制特点
2.1 基础免疫发病机制
人体通过保持促炎和抗炎系统平衡来维持正常免疫[22]。细胞因子可分为促炎细胞因子(IFNγ、IL-1β、TNFα、IL-6、IL-8、IL-2和IL-17A)和抗炎细胞因子(IL-10、IL-1Ra和TGF-β) [10,23,24]。促炎细胞因子可引起机体发生SIRS和多器官功能障碍综合征(MODS)。ACLF患者发生感染后，机体固有和适应性免疫应答被激活，体内交替出现强烈的SIRS和代偿性抗炎反应综合征(Compensatoryanti-inflammatory response syndrome，CARS)，并伴随固有和适应性免疫系统耗竭和功能紊乱，最终导致多器官功能衰竭和免疫功能"瘫痪"，降低机体对外界病原体清除能力，导致难以控制的感染[25,26]。
SIRS是ACLF的特征之一，约30%ACLF患者的SIRS和MODS发生与感染有关[2]。细菌感染是ACLF并发感染最常见的类型[2]，主要通过病原体相关模式分子(Pathogen-associated molecular pattern，PAMP)和毒素诱发炎症反应[27,28]，并大量释放PAMP，PAMP识别并结合模式识别受体(Pattern-recognition receptors, PRR)，进而活化固有免疫系统，激活转录因子，诱导表达细胞因子等炎症相关因子[11]。毒素不是通过特异性受体进行识别而是通过功能的识别过程。真菌也识别并结合PRR，其表达的PAMP可被钙离子依赖凝集素样受体识别[29]。
ACLF的另一重要特征是免疫瘫痪。杨仁国等[30]研究显示，HBV-ACLF患者继发感染后，体液免疫(IgA、IgG和IgM)和细胞免疫(NK细胞、CD4＋和CD4＋/CD8＋T淋巴细胞)功能均呈抑制状态。最近研究发现，CD14＋HLA-DR－髓源性抑制细胞(Myeloid-derived suppressor cells, M-MDSCs)可消除免疫介导疾病的抗微生物应答作用，ACLF患者的SIRS活化和PAMP释放可触发该类抑制性细胞增殖，M-MDSCs通过抑制T淋巴细胞减少抗微生物的固有免疫应答，导致继发感染；ACLF患者疾病进展中持续存在的M-MDSCs与患者的不良预后和感染发生率增加相关[31]。
2.2 临床常见免疫发病机制
研究显示，无论是欧美还是亚太地区，细菌/真菌感染是ACLF病情进展的主要肝外诱因[32]。由于ACLF患者存在免疫功能紊乱、肠道细菌过度生长、肠内菌群和相关细菌产物的易位等病理生理学特点，易发生感染，更易出现感染性休克。随着ACLF疾病进展，出现免疫瘫痪，易出现IFIs，可加剧器官衰竭[6,15]。ACLF常合并肝硬化，而肝硬化失代偿期患者多伴有免疫功能下降，易并发IPA等疾病，严重者可死亡。呼吸系统真菌感染中的曲霉致病力极强，可引起气管和深部肺组织损伤坏死，进而引起气管黏膜炎症反应和肺部炎性肉芽肿，严重者可发生肺梗死[33]。
研究显示，肝衰竭患者(尤其是慢性肝功能衰竭患者、ACLF患者)SIRS发生率为30%～50%[34]。多种感染和非感染性因素均可诱发SIRS[35,36]。合并SIRS的ACLF患者出现脑水肿和多器官功能衰竭可能性较大，病死率更高，应积极进行抗感染治疗，有效控制感染是改善病情和提高生存率的关键。
ACLF患者SBP首次感染和住院期间再次感染率均较高[20]。SBP的形成是肠道菌群和肠道通透性的变化和全身免疫功能紊乱之间互相作用[37]，这一系列事件促进细菌易位，细菌易位范围从肠腔到肠系膜淋巴结，之后可到体循环[38]。ACLF患者肠黏膜定植菌过度生长，黏膜完整性受损，免疫功能受到抑制，肠道转运延迟，较易发生SBP，腹水也是SBP形成的危险因素[39]，由于ACLF患者免疫瘫痪，体内病原菌不能被正常清除，腹膜腔定植菌在腹水中迅速过度繁殖，易发生感染[37,40]。
ACLF患者内毒素血症易引起免疫瘫痪。当ACLF患者并发感染未得到有效控制，处于免疫抑制和瘫痪状态，免疫抑制因子释放增加、单核细胞失活、T淋巴细胞应答减少，以及细胞凋亡导致免疫细胞减少[41,42,43]，严重者可出现休克和器官衰竭。研究发现，失代偿肝硬化患者内毒素血症发生和单核细胞功能改变与免疫检查点分子Tim-3表达下调有关[44]。ACLF患者出现内毒素血症时，中性粒细胞吞噬功能缺陷，显著增加感染发生率，易合并真菌感染。
诊疗相关免疫发病机制主要有2个。ACLF患者使用的糖皮质激素或免疫抑制剂可降低机体免疫功能，抑制细胞免疫和体液免疫，降低白细胞吞噬能力，引起真菌感染。ACLF患者常行多种侵入性诊疗操作可破坏人体防御屏障，引起真菌感染，进而引起细胞因子级联反应，导致肝细胞坏死凋亡[45]。
3 ACLF并发感染对诊断的影响
ACLF患者并发感染发生率较高，早期诊断和及时治疗对改善患者预后较为重要。因并发感染的危险因素和感染类型较多，ACLF患者并发感染诊断难度较大，而且ACLF患者早期感染症状常不明显，即使并发严重感染，SIRS与免疫瘫痪等免疫特点交织使细菌感染的临床诊断可靠性较低[46]。与基础肝病疾病进展和全身炎症反应相关指标较多，除ACLF晚期并发感染的危险因素涉及的部分指标(AST、ALT、中性粒细胞)外，还包括白细胞计数(WBC)、碱性磷酸酶( ALP)、肌酐、国际标准化比值(INR)和降钙素原(PCT)。基础肝病病情较重、全身炎症反应剧烈的患者病情更加复杂，诊断更加困难[47]。目前微生物培养是ACLF并发感染确诊的金标准，但由于微生物培养阳性率不高，受方法学和抗菌药物治疗的影响，约一半细菌感染培养结果阴性，诊断难度大以及症状不典型的患者易漏诊。为提高诊断性能，除了优化临床已有诊断方法，例如优化PCT阈值，还可评估新的免疫相关生物标志物(CD64、sCD163和IL-6等)，并开发基于病原体核酸检测等方法。生物标志物可帮助早期诊断，寻找ACLF患者并发感染的敏感诊断指标一直是临床研究的重点和难点。
3.1 细菌感染诊断
PCT是一种降钙素前肽物质，主要由甲状腺产生，人体血浆正常PCT水平<0.1 ng/mL。发生细菌感染时，在内毒素和炎症介质，如IL-6和TNF等刺激下，单核细胞和几乎所有组织，如肝脏均可不同程度产生PCT [48]。PCT升高迅速，具有较高特异性，可用于感染性疾病的早期诊断和鉴别诊断。临床上PCT常用于诊断细菌感染和指导抗菌药物治疗。国内已有研究表明，PCT对诊断ACLF并发感染的敏感度为93.24%、特异度为90.00%，真实性、阳性预测值、阴性预测值及约登指数均较高，具有较高的临床评价性能[40]。但最近国外学者对PCT诊断能力提出质疑，诊断ACLF并发感染的PCT阈值仍未达成一致意见。为阐明该问题，Lin等[49]重新评价了PCT在ACLF并发感染患者中的诊断价值，结果表明在诊断肝衰竭并发感染时应提高PCT阈值。ACLF患者未发生感染时PCT水平为(0.75±0.60)ng/mL，并发感染时PCT水平为(1.47±1.83)ng/mL，显著高于非感染组。相较于0.5 ng/mL临界值，PCT临界值为1.01 ng/mL时整体表现最佳，敏感度、特异度、阳性预测值和阴性预测值分别为42.68%、78.85%、60.87%和63.42%。但只提高PCT阈值，其诊断价值仍不令人满意。一方面，在感染进程中生物标志物会发生变化，不同样品收集时间常导致不同结果，另一方面，ACLF未并发感染时也可出现全身炎症反应。因此，更快和更直接地检测细菌或细菌组分或是更好鉴定患者感染的方法。因该研究是一个单中心回顾性研究，仍需更多的大样本多中心研究来阐明此临床问题。
PCT单一指标在诊断ACLF并发感染方面存在缺陷，因此需要联合其他指标提高感染的诊断性能。作为急性期血清蛋白，PCT常联合C-反应蛋白(C-reactive protein, CRP)作为感染早期的标志物[50]。Zhang等[12]报道CRP>12.15 mg/L是ACLF患者并发细菌感染的可靠标志物，敏感度和特异度分别是96.6%和83.3%。多篇文献报道，PCT和CRP已广泛应用于感染性疾病的诊断和鉴别诊断[51]，对ACLF患者并发感染早期判断具有一定作用，同时还可用于判断疾病严重程度[52,53,54]。
外周血中性粒细胞CD64(Neutrophil CD64，nCD64)是免疫球蛋白IgG Fc受体之一，其作为感染的生物标志物已被研究多年。机体发生细菌感染时nCD64显著升高，感染控制后48 h内开始下降[55]，在早期识别细菌感染及判断抗感染效果等方面具有较高的临床应用价值[56,57]。尽管作为炎症指标，nCD64和PCT对细菌感染诊断和抗感染疗效评估都有重要参考价值，但其联合用于诊断ACLF并发感染的研究较少见。熊克宫等[46]研究发现，对于HBV-ACLF患者并发细菌感染，相较单一指标，nCD64和PCT联合指标在早期诊断方面效果更佳。研究发现，nCD64、PCT和CRP等指标的两个或三个组合对脓毒症的诊断准确性均较单项指标高[58,59,60,61]。
研究表明，D-二聚体(D-dimer, DD)也是一种预测早期感染疾病的生物标志物，随着DD水平升高，病死率增加[62]。相关研究发现，感染患者发生炎症反应时常伴有凝血功能异常[62]，炎症因子通过促进血管内皮细胞相关组织因子表达激活纤溶系统，增强机体的凝血功能，同时纤维蛋白降解形成DD[63]。
此前较多学者研究结果均显示，单一指标对肝病并发感染不具有绝对诊断价值，需联合检测多项指标才可准确预测病情进展及并发症的发生[50]。故联合使用PCT、CRP和DD等指标来筛选早期诊断和病情监测指标，并证实上述指标均对ACLF具有重要意义。因此，PCT、CRP、nCD64和DD在机体发生细菌感染时迅速升高可作为早期诊断标志物，指标联合诊断可提高诊断准确性。
3.2 真菌感染诊断
真菌感染的部位包括口腔、腹腔、泌尿道等，临床表现常缺乏特异性，且常合并细菌感染，易被肝衰竭或并发症症状掩盖，发生误诊和漏诊。真菌检出率低，早期诊治较困难，因此需要研发针对性的早期诊断方法[45]。真菌感染的诊断分为确诊、临床诊断、拟诊和未诊，病原学检查仍是金标准[64]。
真菌诊断方法主要包括直接涂片、真菌培养和组织病理学检查。近年来，血清学检查也取得较快进展，主要包括1，3-β-D葡聚糖试验(G试验)和半乳甘露聚糖试验(GM试验)。G试验连续两次阳性可作为IFIs临床诊断标准，作为早期诊断的有效方法，GM试验可反映感染程度；G试验联合GM试验可明显提高检测准确率。Verma等[6]发现，1，3-β-D-葡聚糖(1，3-β-D-Glucan, BDG)和半乳甘露聚糖指数(Galactomannan index, GMI)是有效诊断ACLF患者合并IFIs的生物标志物。血清BDG和GMI是早期诊断标志物，可及时指导ACLF患者抗真菌治疗，诊断IFIs的BDG(临界值80 pg/mL)和GMI(临界值0.5)标志物的敏感度、特异度和受试者工作特征曲线下面积(AUC)分别是97.4%、60%、0.770和43.6%、100%、0.745[6]。BDG是诊断IFIs最敏感的单一标志物，GMI诊断IFIs特异度较高。相较非IFIs患者，IFIs患者血清GMI水平更高[0.4(0.2～4.6)比0.2(0.1～0.4)，P＝0.006]，BDG水平(pg/mL)也更高[308(87～500)比74 (30～500)]。相较幸存患者，研究人群死亡者具有更高BDG阳性率和更高BDG水平。但因本研究是单中心回顾性研究，需要进一步研究验证。在临床应用中，甘露聚糖抗原、烯醇化酶抗原、念珠菌热敏抗原、隐球菌荚膜多糖抗原、组织包浆抗原和D-阿拉伯糖醇等也是真菌感染的检测指标[45]。
3.3 核酸诊断方法
目前细菌感染的检测方法逐渐纳入了基于核酸的替代方法。与传统培养方法相比，PCR(16S PCR)用于检测腹水细菌DNA的敏感度和特异度分别为100%和91.5%[65]。声阻抗匹配缓冲液的应用使得从高浓度血细胞中分离细菌成为可能[66]，该方法可回收99.7%细菌，同时去除99.9%以上血细胞，1 mL未稀释全血处理耗时12.5 min，富集的细菌随后再进行声浓缩和PCR检测[67]。
研究表明，反向杂交试验(Reverse blot hybridization assay, REBA)、脓毒症ID试验可快速检测并鉴定革兰阳性菌、革兰阴性菌、真菌和耐抗菌药物基因[68,69]。
Aguirre等[70]开发了基于核酸酶的检测方法。样品在培养4 h后，通过检测DNA酶或脱氧核酶，单菌落形成单位的细菌都能被检测到。为检测细菌浓度，Aguirre等[70]将酶链展开后与脲酶标记DNA杂交，使脱氧核酶固定在磁珠上，不经过细菌培养，每个脲酶可被转换约1014次，使另一层信号扩增，允许选择性检测约103个大肠杆菌细胞[71]。
Kang等[72]提出了一个基于整合脱氧核酶实时传感器、液滴微流体和三维粒子计数器系统的新技术系统，该技术称为集成式综合液滴数字检测，可在感染1.5～4 h内检测到单个极低浓度细菌(每1 mL血液检测范围1～10 000个细菌)。另一个新技术基于aptamer捕获平台，称为"Apt-Fe3O4@TiO2纳米颗粒"[73]，该捕获平台可结合靶标细菌，具有较高选择性和较强亲和力，相比血培养，可显著缩短鉴定时间(2 h比3～5 d)。尽管两个系统均表现出较高敏感性和有效性，但昂贵的检测费用限制了其广泛使用。然而，早期诊断新技术正处于快速研发阶段，显示出较大潜力。
以PCR技术为主的分子生物学检测在真菌诊断领域也取得较快进展，但需根据个体情况谨慎选择PCR试剂盒，缺乏标准[74]。
3.4 新兴生物标志物
较多新兴生物标志物相继出现，如血清前列腺素(Prostaglandin E2, PGE2) [75]，腹水乳铁蛋白[76]、血清抗中性粒细胞胞浆抗体[77]，单核细胞清道夫受体CD163(Scavenger receptor CD163, sCD163)[78]和血清IL-6[79]。血清PGE2水平与免疫瘫痪显著相关，因此血清PGE2与ACLF患者并发感染易感性相关。PGE2水平降低时，免疫抑制减轻，感染风险减少，血清PGE2水平升高可作为诊断ACLF患者感染发生的潜在标志物，ROC曲线下面积为0.83，敏感度和特异度分别为78.4%和81.5%，阈值141 pg/mL。相较非SBP患者，肝硬化SBP患者腹水乳铁蛋白浓度更高，临界值为242 ng/mL，敏感度和特异度分别为95.5%和97%，ROC曲线下面积为0.98，腹水乳铁蛋白床边定性检测易开发，是迅速可靠的SBP筛选工具[76]。两年随访发现，具有抗中性粒细胞胞浆抗体IgA的肝硬化患者有更高感染风险，肠道黏膜免疫系统参与是该分子形成的重要原因，或可反映细菌组分持续暴露[77]。sCD163水平随着感染严重程度逐渐增加，提示细菌感染过程中抗炎反应起重要作用，可用于检测失代偿肝硬化并发细菌感染的死亡风险[78]。荟萃分析表明，IL-6在肝硬化患者并发细菌感染方面具有鉴别诊断价值[79]。然而上述标志物未在ACLF并发感染人群中验证过，其诊断价值和临床应用需进一步研究。
有效检测病原体的方法常处于更新状态，试验方法高成本限制了其广泛使用。因此，早期诊断新技术亟待更新发展以用于临床实践[15]。
4 总结与展望
细菌和真菌感染是ACLF患者常见并发症，由于其发病因素复杂，具有较高感染率和病死率，迫切需要早期诊断来改善该类患者预后，且亟需新方法提高早期感染诊断的准确性。随着对感染流行病学和免疫发病机制的深入了解，可更好地评估并优化已有诊断方法的临床价值，并有助于未来研发新的诊断方法。
引用: 应高翔, 杨英, 吴凤天, 等. 慢加急性肝衰竭患者并发感染的特点及对诊断的影响 [J] . 中华临床感染病杂志,2020,13 (02): 140-148.